临床试验中随机化的应用，可以有效平衡组间各类混杂因素，从而得到因果效应。然而观察性研究设计中，往往存在各种混杂因素，包括已知的、未知或未测量的混杂因素，使得在识别处理因素与结局的因果关系时存在一定的挑战。
对于已知的混杂因素，目前已有多种统计方法可以使用，包括分层、匹配、回归、加权等，而未知/未测量混杂因素也会导致研究出现虚假关联，针对未知混杂也有相应的一些统计方法涌现，如工具变量、本底事件率、阴性对照等。本次简单介绍一种识别和控制未测量混杂的方法-阴性对照（negative control）。
阴性对照的思想比较简单，在预期产生阴性结果的条件下，结果应该是阴性。阴性对照可以分为阴性暴露对照（negative control exposure，NCE）、阴性结局对照（negative control outcome，NCO）。下面结合有向无环图对阴性对照的概念进行介绍。
首先定义几个符号，假设L为已知且测量的混杂因素，U为未测量混杂，A为关心的暴露因素，Y为结局变量，W为NCO，Z为NCE。
阴性暴露对照
在研究A与Y的关系时，找一个Z，Z-Y、A-Y有着相同的混杂结构（Z和A满足U-comparable）同时Z与Y理论上不存在关联（无Z直接指向Y的箭头），Z就叫做阴性暴露对照，见下图：
此时，针对A-Y做分析，然后针对Z-Y做同样的分析，但是需要同时控制A，如果Z-Y之间得到关联，而实际Z-Y应该是无关联的，则提示可能存在未知因素未得到控制。
阴性结局对照
在研究A与Y的关系时，找一个W，A-W与A-Y有着相同的混杂结构（Y和W满足U-comparable）同时A与W理论上不存在关联，W就叫做阴性结局对照，见下图：
此时，针对A-Y做分析，然后再针对A-W做同样的分析，同样，如果A-W得到关联，则提示可能存在未知因素未得到控制。
以上介绍的是通过阴性对照来识别潜在的未知因素，接下来结合线性模型介绍如何校正混杂因素的理论，为了方便介绍这里将NCE、NCO放在同一个有向无环图中，这又被叫做双向阴性对照。
通过上图，有以下关系式：
U是未知的，无法直接建模，因此将公式(3)分别代入(1)、(2)，Y，A，W，Z都是已知的因素：
从公式(5)看出，如果不考虑U，此时通过模型(5)直接得到的估计为βYA(真实的因果效应)+βYUβUA(confounding bias)即A的系数，通过(5)无法直接将βYA分离出来。
如果单独应用阴性结局对照（可忽略公式(5)和(7)中的Z），根据NCO的理论，A与W实际并不存在关联，那么公式(7)中的βWUβUA即A的系数理论上为混杂偏倚的效应，从而有βWUβUA=βYUβUA。最后从(5)中A的系数扣除混杂的效应即可。
如果单独应用阴性暴露对照（则只有公式(5)），根据NCE的理论，Z与Y实际并不存在关联，那么公式(5)中的βYUβUZ即Z的系数理论上为混杂偏倚的效应，从而有βYUβUZ=βYUβUA。最后从(5)中A的系数扣除混杂的效应即可。
如果同时应用阴性结局对照和阴性暴露对照，公式(5)中Z的效应为βYUβUZ，公式(7)中Z的效应为βWUβUZ，那么βYUβUA(confounding bias)= βWUβUA（βYUβUZ）/（βWUβUZ），即混杂=公式(7)求的A的系数*（公式(5)求的Z的系数/公式(7)求的Z的系数）。
应用案例
目前阴性对照理论的应用，多集中在使用其识别是否存在潜在的未控制混杂，例如下面发表于JAMA上的一项研究。
研究目的：通过回顾性队列研究，探讨静脉曲张是否与深静脉血栓栓塞、肺栓塞和周围动脉疾病风险增加有关。
研究人群：851,936名数据库中的受试者
暴露因素：是否患有静脉曲张
主要结局：深静脉血栓栓塞、肺栓塞和周围动脉疾病
统计分析方法：
具体的统计分析细节详见文献，这里只介绍部分主分析。使用Cox模型计算静脉曲张与几个终点间的HR。
对于阴性暴露对照，使用了血管瘤，这是一种类似于静脉曲张的血管状况，但不太可能导致深静脉血栓栓塞、肺栓塞和周围动脉疾病。假设血管瘤与深静脉血栓栓塞、肺栓塞和周围动脉疾病之间的关联可能意味着存在无法测量的混杂。使用Cox模型计算血管瘤与几个终点间的HR。
对于阴性结局对照，使用肺癌癌症和高脂血症，根据任何已知的病理生理机制，它们与静脉曲张无关。因此，静脉曲张和这些终点之间的联系可能表明存在无法测量的混杂。使用Cox模型计算静脉曲张与肺癌癌症和高脂血症间的HR。
研究结果：阴性对照分析显示，静脉曲张使肺栓塞和周围动脉疾病发病风险增加的微弱效应可能是残余混杂的结果。
总 结
阴性对照的思想还可以应用到真实世界研究，例如阴性对照采用外部对照的单臂研究由于混杂因素、人群异质性和各种可能偏倚的影响，因果推断结论具有较大的不确定性，为克服或减少这些局限也可以考虑使用阴性对照。
阴性对照的选择很重要但是又比较困难，需要满足以下条件：
1. 独立于研究结局（或暴露因素）：阴性暴露对照不会导致结局的发生，感兴趣的暴露不会导致阴性结局对照的发生。
2. 有相同的混杂结构（图一、图二）。
3. 阴性对照需要有一定的统计效能。如果阴性对照变量比较罕见，或者如果未测量的混杂因素和阴性对照变量之间的关联较弱，那么可能需要大样本来获得足够的检测混杂的能力。
阴性对照适应于观察性研究中的比较性研究，如研究是否使用某种药物对结局的影响。如果在研究设计阶段，存在先验知识表明某因素可以作为阴性对照使用时，阴性对照的分析可以作为观察性研究的敏感性分析从而增强证据力度。实际使用时建议应用时从专业角度选择多个NCE或NCO，以说明结果的可靠性和稳健性。
参考文献
[1] Lipsitch M, Tchetgen Tchetgen E, Cohen T. Negative controls: a tool for detecting confounding and bias in observational studies [published correction appears in Epidemiology. 2010 Jul;21(4):589]. Epidemiology. 2010;21(3):383-388. doi:10.1097/EDE.0b013e3181d61eeb
[2] Shi X, Miao W, Tchetgen ET. A Selective Review of Negative Control Methods in Epidemiology. Curr Epidemiol Rep. 2020;7(4):190-202. doi:10.1007/s40471-020-00243-4
[3] Chang SL, Huang YL, Lee MC, et al. Association of Varicose Veins With Incident Venous Thromboembolism and Peripheral Artery Disease. JAMA. 2018;319(8):807-817. doi:10.1001/jama.2018.0246
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